消除异种器官移植风险
内源性逆转录病毒失活的基因编辑猪。研究人员利用基因编辑CRISPR/Cas9技术敲除关键基因后，使得猪内源性逆转录病毒彻底丧失感染能力，扫除了异种器官移植研究的最大安全风险。（资料图/图）
（本文首发于2017年10月5日《南方周末》）
哈佛大学的丘奇团队利用基因编辑技术成功敲除猪体内潜在的病毒基因，这一结果对消除异种器官移植的安全风险具有重要意义。
2017年9月22日，《科学》杂志正式刊登了美国哈佛大学遗传学家乔治·丘奇教授团队的基因敲除猪最新研究成果，在多位中国科学家参与下，该团队利用CRISPR/Cas9技术对猪细胞内的内源逆转录病毒（PEPV）基因进行了基因编辑，使其失去感染能力，并培育出内源逆转录病毒失活的基因敲除猪。
潜在的危险
器官移植是挽救器官受损或衰竭患者的主要手段，也是现代医学的巨大成就之一，但是器官供体短缺一直是制约器官移植发展的最主要因素。据美国器官募集和移植网络（OPTN）数据，截止到2017年9月21日，美国等待器官移植的病人有11.7万人，1-8月共完成2.3万例器官移植手术，而器官捐献数量仅为10868例。十多年来，美国每年完成器官移植手术和器官捐献的数量基本维持在同一水平，但等待器官移植的患者数量却从十五年前不足8万，增加至目前的近12万。全球其他国家也是类似情况，中国器官移植供需矛盾更加突出。
由于猪的器官大小、生理结构等与人非常相似，而且易于获得，因此猪被认为是异种器官移植的理想供体。一些科学家已将基因改造的猪器官移植到灵长类动物身上，包括心脏、肺脏和肾脏等器官，这些猪器官在灵长类动物体内最长存活时间可达900天以上，猪器官移植的人体临床试验也已在计划之中。
不过，猪体内存在很多内源性逆转录病毒基因，这些病毒基因可能是远古逆转录病毒感染猪的祖先后，残留在猪祖先基因组内，变成猪基因组中可稳定遗传的一部分。虽然目前没有临床证据表明这些病毒基因能够复活，甚至感染人类，但是还是有人担心存在这种可能。
早在二十年前，英国伦敦大学癌症研究学院的卡莱文·帕特恩等人发现猪肾脏细胞的内源性逆转录病毒基因可在体外感染共培养的人类细胞。随后，德国慕尼黑大学的研究人员也发现猪的内源性逆转录病毒基因同样可感染狒狒的细胞，因此，猪内源性逆转录病毒被认为是猪异种器官移植临床试验的最大安全风险。
乔治·丘奇教授团队2015年10月在《科学》杂志首次报道了利用CRISPR/Cas9技术，一次性敲除猪基因组中内源性逆转录病毒编码逆转录酶基因的全部62个拷贝，并证明失活的猪内源性逆转录病毒，对与猪细胞共培养的人类细胞的感染能力大幅下降，只相当于未基因编辑猪细胞的千分之一以下。
这项研究首次在细胞水平上解除了猪内源性逆转录病毒的潜在感染风险，扫除了异种器官移植的主要安全障碍，引起广泛关注，《自然》杂志以“人-猪器官移植的新时代”为题加以报道，《自然生物技术》杂志则配发“异种器官移植回来了”的新闻报道。
不到两年时间，乔治·丘奇教授团队再次在《科学》上发表了最新研究成果，不仅再次证明猪内源性逆转录病毒能感染共培养的人类细胞，而且这种猪内源性逆转录病毒还能在人类细胞之间水平转移，也就是说，在共培养条件下，猪内源性逆转录病毒可以从已感染的人类细胞转移到未接触过猪细胞的人类细胞，虽然只是这些内源性逆转录病毒的基因在转移，也没有证据表明这些病毒基因能制造出病毒颗粒，并具有致病性，但是异种器官移植过程中可能存在猪内源性逆转录病毒感染人类细胞的潜在风险，因此对于异种器官移植来说，制备猪内源性逆转录病毒基因失活的基因编辑猪显得非常必要。
基因编辑猪
乔治·丘奇教授团队对猪肾上皮细胞的基因组进行进一步分析，发现猪内源性逆转录病毒具有功能性的拷贝共有25个，即这25个拷贝中编码逆转录酶的基因较为完整，具有潜在感染能力。只要将这些逆转录酶基因所有拷贝敲除，即可使所有内源性逆转录病毒丧失移动能力而失活。为了获得基因编辑猪，研究人员针对25个逆转录酶基因拷贝的核心区域，设计了特异性指导RNA，让这些RNA与猪胎儿成纤维细胞待一段时间后，这些RNA很快会在猪的全基因组中寻找并结合到逆转录酶基因核心区域，随后，与之相连的核酸内切酶Cas9就会剪除这一区域，这样就获得了25个逆转录酶基因拷贝均被编辑的猪胎儿成纤维细胞。之所以采用猪胎儿成纤维细胞，而非之前采用的肾上皮细胞，主要因为这种胎儿成纤维细胞是生产克隆猪的最常用细胞，从猪的皮肤组织即可分离获得，克隆效率也要比大多数其它细胞更高。
基因编辑猪细胞制备成功后，研究人员还对这些细胞进行了全基因组脱靶分析，没有发现CRISPR/Cas9基因编辑工具错误剪切猪基因组中其它位点。接下来，研究人员将这些基因编辑细胞进行核移植操作，即将这些基因编辑细胞核取出，与去核的卵母细胞融合成克隆胚胎，接着将克隆胚胎移植到代孕的母猪体内进行发育，共出生37个基因编辑克隆猪，其中15头健康存活，年龄最大的已有5个月以上了。
这些克隆猪是世界上首批内源性逆转录病毒失活的基因编辑猪。目前，研究人员已从基因编辑克隆猪体内分离出细胞，正在进行长期观察，以验证这些基因编辑克隆猪体内失活的内源性逆转录病毒是否还有没有感染能力。
这项研究8月初在线发表后同样引起媒体的广泛关注，美国《财富》、《时代》周刊、《科学美国人》、《纽约时报》、《福布斯》等媒体均加以报道。
当然，除了内源性逆转录病毒，猪的异种器官移植最为关键的技术难题在于如何避免猪的器官移植到人体后所引发的各种免疫排斥反应，科学家们在这个领域已经努力了十多年，通过将一些容易引发免疫排斥反应的猪基因敲除，同时加入一些人体基因，将猪的器官人源化，虽然取得了一定进展，但是还远没有达到临床要求，还需要更多科学家、更长时间的努力，而中国科学家正成为这一研究领域的主力军。
新的生力军
值得关注的是，在这篇《科学》杂志上发表的研究论文中，22名作者中共有16名中国科学家。杨璐菡博士是本项研究的共同通讯作者之一，也是2015年10月《科学》杂志上猪细胞内源性逆转录病毒失活研究论文的第一作者。2015年，这位本科毕业于北京大学的80后女孩与她的博士生导师乔治·丘奇教授共同成立eGenesis生物公司，杨博士任公司首席技术官，专注于利用基因编辑技术开展猪的异种器官移植研究和开发，而成功敲除猪的内源性逆转录病毒并培育无安全风险的基因编辑猪，使得这家新进的公司一下子成为异种器官移植研究领域的领导者，同时也使异种器官移植重新得到科学家、投资者和公众的关注。2017年3月，eGenesis公司获得3800万美元投资，有望加快异种器官移植临床应用的进程。
除了杨璐菡博士，还有来自浙江大学、云南农业大学、第三军医大学、深圳市金新农科技股份有限公司的15位中国科学家参与这项创新研究。杨璐菡博士也在接受媒体采访时，表示将与中国研究机构加强合作，共同开发基因编辑猪，并推动异种器官移植临床试验。
与此同时，中国早已有多个研究机构进入猪异种器官移植研究领域。中南大学湘雅三医院王维教授团队多年来一直在开展猪胰岛细胞治疗I型糖尿病研究，截止到2017年9月8日，该团队已利用猪胰岛细胞成功治疗10位I型糖尿病患者，相关技术体系和临床方案通过了专家评审，已正式开启大规模临床试验，计划每年治疗1万名以上的I型糖尿病患者。虽然临床试验所采用的猪胰岛细胞并非经过基因改造，但是与湘雅三医院密切合作的湖南赛诺生物科技有限责任公司已培育出人源化的基因改造猪，计划不久将用于治疗糖尿病的临床研究。
南京医科大学“千人计划”特聘专家戴一凡教授团队则培育出一种人源化基因编辑猪，2017年1月，戴教授与北京同仁医院眼科中心合作，将人源化基因编辑猪角膜移植到西藏猕猴眼睛中，基因编辑猪的角膜在猕猴眼睛中存活171天，但是没有进行基因改造的猪角膜则存活157天，差异并不显著，原因可能是角膜移植本身免疫排斥较小，人源化猪角膜抗排斥优势并不明显。
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所潘登科博士团队也培育了多种人源化改造的基因编辑猪，最近与深圳大学第二人民医院、中山大学等单位合作，对一种双抗原基因敲除猪进行了抗移植排斥反应的分析，初步发现32个基因与异种移植排斥反应相关。之后，潘登科博士又利用另一种人源化克隆猪与第四军医大学和解放军总医院等单位合作，进行了猪肝脏移植到西藏猕猴体内的研究，发现异种移植后受体的细胞因子发生了重要变化，为后续异种器官移植研究奠定基础，这些研究成果均发表在《异种器官移植》杂志上。
随着内源性逆转录病毒失活基因编辑猪的诞生，异种器官移植的安全风险基本解除，下一步则需要重点攻克移植免疫排斥反应这一异种器官移植领域最大的障碍，中国科学家将与国际同行一道，为突破这一难关贡献自己的力量。
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轉載自: http://www.antpedia.com/news/35/n-1353035.html
基因修饰猪：为糖尿病人提供胰岛素
2016年3月，《分子细胞生物学杂志》在线发表了中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组的研究成果。该研究利用基因编辑技术对猪胰岛素基因进行无痕定点修饰，使猪胰岛素基因编码生产人胰岛素，成功建立了完全分泌人胰岛素的基因编辑猪。
人源化胰岛素基因修饰猪可为糖尿病治疗提供人胰岛素，也可为临床异种胰岛移植治疗提供更理想的供体来源。
据介绍，医学界目前对糖尿病的治疗广泛使用了猪源胰岛素，但由于猪胰岛素蛋白与人胰岛素蛋白存在一个氨基酸的差异，导致效用降低，长期使用也容易诱发抗体产生。
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